Propagación in vitro de Mammillaria luethyi G.S.Hinton

Introducción

México es el país que alberga el mayor número de especies de cactáceas en el mundo. Están presentes en las actividades de comunidades aisladas como parte de su alimentación, forraje para ganado, remedios caseros, combustible, ornamentación y cercado de viviendas. En las últimas décadas la amenaza de extinción sobre algunas cactáceas se ha incrementado debido a su recolección excesiva con fines ornamentales, demanda en el uso del suelo, crecimiento en el área urbana y a las condiciones climáticas adversas propias de las zonas áridas y semiáridas donde se desarrollan.

El género Mammillaria es uno de los más diversos de la familia Cactaceae, dentro de él se ubica Mammillaria luethyi, especie endémica conocida solamente en su localidad tipo, en el Norte de Coahuila, de la que se desconoce su distribución y dinámica poblacional, lo que la hace muy apreciada por coleccionistas. Actualmente se propaga  por esquejes, pero su crecimiento es muy lento, razón por la cual es de suma importancia propagarla in vitro de manera eficiente y rápida, lo que permitiría satisfacer las demandas del mercado y asegurar su  conservación. Clayton et al. (1990); Rublo et al. (1993) y Smith et al. (1991),  mencionan que el cultivo in vitro es un método potencial para la conservación de especies raras o en peligro de extinción, por su parte Malda, et al. (1999) indican que las cactáceas poseen un metabolismo ácido crasuláceo (plantas MAC), que tienen capacidad reproductiva limitada y tasas de crecimiento muy lento. Al comparar tasas de crecimiento de cultivo in vitro y ex vitro es evidente que in vitro se acelera notablemente su velocidad de crecimiento, además permite su  multiplicación, generando una gran cantidad de individuos a partir de la planta madre. Por lo anterior el objetivo del presente trabajo fue la propagación in vitro de M. luethyi,  probando para ello el efecto de dos medios nutritivos  con diferentes concentraciones de  reguladores de crecimiento (auxinas y citocininas), para inducir la formación de brotes a partir de callo.

                                                                                                                        

Metodología experimental

El trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Departamento de Fitomejoramiento de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro y en el invernadero del Museo del Desierto cuyo procedimiento experimental se describe a continuación:

Establecimiento del cultivo aséptico y formación de callo de Mammillaria luethyi

Las plantas madres fueron establecidas en el invernadero y  tratadas cada quince días con tectol (1 mgL^-1) durante 3 meses, luego fueron trasladadas al laboratorio, donde bajo condiciones de asepsia absoluta, se tomaron de su base 20  tubérculos, que constituyeron los explantes primarios. El proceso para lograr su desinfección consistió en sumergir los tubérculos en kanamicina (50 mgL^-1) y tectol (100 mgL^-1 ) durante 5 minutos. Posteriormente se enjuagaron por un minuto tres veces con agua destilada estéril. Los explantes primarios se colocaron en frascos gerber con medio nutritivo de Murashige y  Skoog (MS) y se llevaron al cuarto de incubación. A las cuatro semanas se transfirieron a medio nuevo. Finalmente los explantes fueron colocados, para la producción de callo, en medio MS suplementado con 85 mgL^-1  NaH₂PO₄, 250 mgL^-1 de myo-inositol, 1 mgL^-1 de tiamina-HCL, 1 mgL^-1 de piridoxina-HCL, 30 gL^-1 de sacarosa, 3 mgL^-1 de 2,4-D y 9 gL^-1 de agar; ajustado a un pH de 5.8. El callo que creció a las 4 semanas fue subcultivado por 3 ocasiones en el mismo medio y mantenido en el cuarto de incubación con temperatura de 24 ± 1°C y fotoperíodo de 16 horas.

Micropropagación de brotes a partir de callos de Mammillaria luethyi

Para la formación de brotes se partió de callos, que bajo condiciones de esterilidad total, se seccionaron en piezas de aproximadamente 3 mm³ y fueron sembrados en frascos con medio nutritivo. Se estableció cada tratamiento con cuatro repeticiones, cada repetición constó de un frasco gerber con cuatro piezas de callo, que conformaron un total de 48 tratamientos procedentes de la combinación de tres factores, el primero de ellos, Factor A, correspondió a medios nutritivos, Murashige and Skoog (MS) y PCL2; el segundo, Factor B, a tipos de citocininas, bencilaminopurina (BAP) y kinetina (K) a concentraciones de 0.0, 1, 3 y 10 mgL^-1 y el tercero, Factor C, a concentraciones de ácido naftalenacético (ANA) (0.0, 0.1 y 1.0 mgL^-1). Todos los medios nutritivos fueron suplementados con 100 mgL^-1 de myo-inositol, 1 mgL^-1 de tiamina-HCL, 1 mgL^-1 de piridoxina-HCL, 20 gL^-1 de sacarosa y 9 gL^-1 de agar; ajustado a un pH de 5.8. Los frascos finalmente fueron trasladados al cuarto de incubación con fotoperíodo de 16 horas luz, a temperatura de 24 ± 1°C. El número de brotes conformados en cada tratamiento se registró a las doce semanas de desarrollo. El experimento se estableció bajo  un diseño completamente al azar con arreglo factorial y se realizaron pruebas de rango múltiple de Duncan para encontrar la diferencia entre tratamientos con un nivel de significancia del 5%.

Resultados y discusión

Los resultados obtenidos indicaron que de los factores evaluados, el único que logró la producción de brotes de M. luethyi fue el Factor C, que corresponde a tipos y concentraciones de citocininas, encontrándose que los tratamientos que produjeron la mayor cantidad de brotes por explante 2.16, 1.83 y 1.58 correspondieron a los tratamientos que contenían 1 mg/l BAP, 3 mgL^-1 BAP y 1 mgL^-1 K respectivamente, mientras que los tratamientos que contenían altas concentraciones de citocininas produjeron callo friable. El efecto de BAP y K solos, favoreció la expresión morfogenética para la producción de brotes. La escasa respuesta por parte de las secciones de callo a la adición de 3 concentraciones de auxina, en este caso ANA (0.0, 0.1 y 1.0 mgL^-1), Factor C, indicó que la cantidad requerida para que se conformaran los brotes la sintetizó el explante en forma endógena, por lo que no fue necesaria su presencia. Los resultados no concuerdan con lo reportado por Clayton et al. (1990) al micropropagar 11 especies de cactáceas, entre ellas una del género Mammillaria,  por Martínez y Rublo (1989) que lograron la propagación in vitro de Mammillaria san-angelensis y por Rodríguez y Rublo (1992) que micropropagaron Aztekium ritteri quienes requirieron la adición de citocininas y auxinas a diferentes concentraciones en los medios nutritivos que utilizaron para la proliferación de brotes.

En lo que respecta al Factor A, medios nutritivos, no se encontró diferencia  entre ellos en cuanto a número de brotes, pero el medio PCL2 resultó ser cualitativamente mejor.  Resultados similares se reportan en otros trabajos realizados como el de Clayton et al. (1990) con cactáceas y  Phillips y  Collins (1979) en otras especies de plantas, en donde se reporta como mejor medio el medio PCL2, que difiere del medio MS por contar con concentraciones mayores de Magnesio, Calcio y Sodio. En la Figura 1 se muestra una plántula de M.luethyi desarrollándose en un medio nutritivo PCL2 con 1 mgL^-1de BAP.

Figura 1.- Plántula de Mammillaria luethyi en medio

         de cultivo PCL2 con 1 mgL^-1 de BAP

                                              

Conclusiones

La regeneración de brotes se logró a partir de callo, encontrándose la mayor cantidad de brotes a concentraciones de 1 mg/l  BAP, 3 mgL^-1 BAP y 1 mgL^-1 de K. No se requirió la presencia de auxina en la producción de brotes. Los medios nutritivos MS y PCL2 produjeron el mismo número de brotes pero de mejor calidad en PCL2.